Реакция непрямой гемолитической агглютинации (РНГА)

Реакция непрямой гемолитической агглютинации (РНГА) относится к серологическим методам исследования. Серология – наука об изучении различных свойств плазмы крови. Если точнее говорить, то серология изучает взаимодействие антител, находящихся в организме человека, с определёнными антигенами. В медицинской клинико-лабораторной диагностики серология является одним из разделов иммунологии.

Основными серологическими методами исследования являются различные реакции. Такие реакции, как правило, делятся на прямые и косвенные. В свою очередь прямые бывают двухкомпонентными – это агглютинация, гемолитическая агглютинация или реакция преципитации. А косвенные реакции в основном трехкомпонентные, к ним относятся реакции торможения гемолитической агглютинации и нейтрализации (микроорганизма и вируса).

Агглютинация представляет собой слипание и выпадения в осадок клеток, имеющих определенный антиген, который вступил во взаимодействие с таким же антигеном. Реакция преципитации помогает определить в организме или исследуемом материале неизвестный антиген путем добавления определенного антитела. В результате при положительном результате выпадает осадок в виде хлопьев.

Такие исследования проводят для определения инфекционного или бактериологического заболевания. К сожалению, такие методы не являются однозначными в диагностики данных групп заболеваний. Поэтому при постановке диагнозов следует учитывать анамнез пациента, клинические проявления заболевания, а также назначать дополнительные подтверждающие методы исследования.

Реакция непрямой гемолитической агглютинации (РНГА) – этот метод специфичен для определения инфекционных заболеваний, вызванных бактериями (например, сальмонеллезов или дизентерии), риккетсиями, простейшими или грибами. Также этот метод эффективен в отношении диагностирования сифилиса.

Принцип метода РНГА

При постановке реакции используются эритроциты (может использоваться латекс), которые имеют на своей стенке определенные антигены. К планшету с эритроцитами добавляется исследуемый материал. Если в нем имеются специфические антитела или белки определяемого возбудителя заболевания, то они вступают в связь с антигенами, слипаются и образуют видимый осадок.

Стандартный набор в основном содержит пустой планшет, эритроциты баранов, которые и имеют чувствительность к антигену выявляемого заболевания. Также в наборе присутствуют эритроциты, не имеющие антигенов. Контроли – положительный и отрицательный и стандартный реактив для разведения сывороток.

Самое главное в постановке реакции – это строгое соблюдение всех этапов. Для начала берут пустой планшет для РНГА, в лунки раскапываются последовательно заранее разведенные исследуемые образцы. В первую и последнюю лунки капают контроли. К сывороткам добавляют эритроциты со специфическими антигенами. Инкубируют планшет 2 часа.

Далее описывают визуальный результат. Он учитывается в крестах. Реакция считается верной только тогда, когда контроли прошли реакцию. Соответственно, в лунке с положительным контролем эритроциты располагаются по всему дну в виде хлопьев («зонтик»). В случае с отрицательным контролем на дне лунки выпадает маленькое четкое кольцо из эритроцитов («пуговка»).

Учет результатов

Результат учитывается по интенсивности осадка из эритроцитов в лунке.

• «-» отрицательный результат, как отрицательный контрольный образец, в виде плотного кольца на дне без какой-либо зернистости.
• «+» слабая интенсивность реакции, кольцо на дне в виде «пуговки», но при этом видны отдельные отложения эритроцитов. Результат описывается как «сомнительный». Обязательная пересдачи крови через 2 недели.
• «++» средняя интенсивность прошедшей реакции. Образовавшееся кольцо на дне лунки достаточно широкое с просветом в центре. Результат трактуется как слабо положительный.
• «+++» интенсивная реакция. В лунке эритроциты занимают всю поверхность, выпадают в виде «зонтиков». То есть с тонким кольцом по периферии. Результат оценивается как положительный.
• «++++» резкая интенсивность реакции. Вся лунка равномерно заполнена зернистыми выпадениями эритроцитов, иногда может быть в виде «зонтика». Также результат считается положительным или резко положительным.

Реакция может быть ложноположительной при протекании в организме человека тяжелых аутоиммунных заболеваний. Поэтому, если при пересдаче анализа реакция дает перекрест и результат отчитывается как ложноположительный, незамедлительно нужно обратиться к врачу для выяснения причины данной реакции.

Иногда этот метод принимают для подтверждения другого метода диагностики, основанного также на связывании антиген-антитело, называемого иммуноферментный анализ.

Подготовка к анализу

Чтобы не допустить ложноположительных результатов, к анализу нужно подготовиться заранее. Забор крови на данный анализ производится строго натощак и без употребления утром какой-либо жидкости. Нужно воздержаться от курения, хотя бы за час до сдачи анализа. Алкогольные напитки стоит исключить из рациона как минимум за сутки до анализа. Кровь на РНГА забирается из вены.

В настоящее время реакцию непрямой (пассивной) гемолитической агглютинации очень широко используют в медицинской лабораторной диагностике. Эта методика впервые была протестирована еще в 1965 году. И до сегодняшнего дня очень востребована. Она дает возможность не только определить, протекает ли в данный момент инфекционное заболевание у человека, но и на какой стадии оно находится.

Используют РНГА чаще всего для скрининга населения на наличие инфекционных заболеваний и для подтверждения положительных результатов, например, на сифилис. Основано это на том, что тест считается достаточно чувствительным и эффективным. Но при этом реакция проста в постановке и не требует много времени, результат можно получить уже в день сдачи крови.

Cергеева Екатерина Андреевна

Серологические методы исследования в диагностике паразитарных заболеваний

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Серологический анализ крови представляет собой способ лабораторного исследования определенных антигенов или антител (специфических белков) в сыворотке крови пациента, основанный на иммунных реакциях организма. Данный метод применяется при диагностике инфекционных заболеваний для выявления наличия антител в крови больного к определенному виду вирусов или бактерий, а также для определения групповой принадлежности крови.

Исследуемый материал

В первую очередь для проведения серологического анализа используют биологический материал, собранный от пациента:

• сыворотка крови
• слюна
• фекальные массы

В некоторых случаях исследуется материал, выделенный из определённых объектов окружающей среды:

• вода
• почва

Методика проведения анализа или забора крови

Данный анализ не требует специальной подготовки пациента. Забор крови проводится утром натощак и, производится в процедурных кабинетах лечебных учреждений, согласно общепринятым гематологическим методикам. Для серологического исследования забор крови производится двумя методами: венозную кровь забирают из локтевой вены пациента, а капиллярную кровь – из безымянного пальца. Кровь помещают в стерильные герметичные пробирки.

Особенности транспортировки крови и хранения сыворотки

Сразу же после забора крови её транспортируют в специальную лабораторию, где в тот же день производится подготовка сыворотки. Хранение сыворотки допускается не более 4 – 6 дней в холодильной камере при температуре 2 – 4 градусов. При необходимости более длительного хранения, сыворотка замораживается. Во избежание нарушения качества сыворотки допускается однократное её замораживание и, соответственно, размораживание. При длительном хранении антитела теряют свои свойства и становятся частично неактивными, наиболее чувствительными к замораживанию являются иммуноглобулины класса М. После размораживания сыворотки необходимо тщательное перемешивание её до однородной массы, что способствует восстановлению концентрации антител, содержащихся в данной сыворотке.

Для чего используют серологические исследования?

Серологические методы лабораторной диагностики используются для выявления таких заболеваний как эхинококкоз, трихинеллёз, токсокароз, описторхоз, цистицеркоз, токсоплазмоз, амебиаз, лямблиоз, для определения эффективности проведённого курса лечения и, наконец, для обнаружения повторного заболевания после полного выздоровления пациента.

Основные методы серологической диагностики

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Данная реакция является непрямым вариантом серологического исследования, то есть, производится она в два этапа. На первом этапе производят выявление необходимого антитела в циркулирующем комплексе антиген – антитело с помощью антиглобулина, схожего по своей структуре с белками иммунной сыворотки. Выявление искомого антитела возможно также при изучении заранее приготовленного антигенного препарата под люминесцентным микроскопом, без использования антиглобулинов.
Иммунофлюоресцентная реакция – очень трудоёмкий процесс, требующий от специалиста немало времени и ответственности. Начинается реакция с подготовки растворов, затем сыворотки и их контрольные образцы подвергаются титрованию (процесс, позволяющий определить содержание определённого вещества путём постепенного смешивания исследуемого раствора с контролируемым количеством реагента). Подготовленные ранее разведения и их контрольные образцы аккуратно наносятся на предметные стёкла с антигеном. Потом препараты подвергаются инкубации, затем следует их отмывание и высушивание на воздухе. На стёкла с антигеном тонким слоем наносится антисыворотка, после этого производится вторичная инкубация препаратов и, вся предыдущая цепь действий повторяется, завершаясь высушиванием препарата. В результате препарат на предметном стекле подвергается обработке глицерином и исследуется в люминесцентном микроскопе.
Результаты проведённой реакции оцениваются по четырёх бальной шкале, которая характеризуется интенсивностью поверхностного жёлто-зелёного свечения клеток антигенов:
+ очень слабое свечение клетки, заметное только на её периферии
++ слабое свечение периферии клетки, но с явно заметным зелёным оттенком
+++/++++ яркое свечение зелёного цвета периферии клетки
Титром реакции считается такое разведение сыворотки, где не менее 50 % клеток антигена проявляют чёткое поверхностное свечение, то есть результат реакции +++ или ++++. Значение тира реакции от 1/80 до 1/100.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Принцип реакции основывается на способности эритроцитов концентрировать антиген на своей поверхности и склеиваться, образуя видимый осадок, при вступлении в контакт со специфическими антителами. Данная реакция очень информативна в диагностике острой формы описторхоза, острой и хронической формы эхинококкоза и трихинеллёза. Иногда РНГА используется для подтверждения результатов ИФА, что помогает повысить достоверность диагностики паразитарных заболеваний. Набор, необходимый для проведения реакции, содержит: (Д+) эритроциты барана, чувствительные к специфическому антигену, (Д-) эритроциты без антигена, (Э) сухие эритроциты барана, (К+) диагностическую агглютинирующую сыворотку – положительный контрольный тест, (К-) нормальная сыворотка человека – отрицательный тест, реагент, применяемый для подготовки раствора, используемого при разведении сыворотки. Постановка реакции происходит в несколько этапов, строго следующих один за другим. Вначале подготавливают необходимые растворы, затем готовят сыворотки и их контрольные образцы, после чего данные образцы наносятся на планшеты. Далее следует нанесение на планшеты сенсибилизированных (Д+) и несенсибилизированных (Д-) эритроцитов барана. Данные препараты инкубируются, и через некоторое время производится учёт результатов. Результаты проведённой реакции учитываются по четырёх бальной системе.
Интенсивность реакции зависит от количества осаждённых эритроцитов на дне образованных лунок:
– отрицательная реакция, которая характеризуется осаждением эритроцитов на дно лунок в виде небольшого колечка с гладкими краями или «пуговки»
+ слабая интенсивность, для данной реакции характерны небольшие одиночные отложения на дне лунки. Неагглютинированные эритроциты образовывают «маленькое колечко» в центре лунки
++ средняя интенсивность, ей свойственно образование на дне лунки «широкого плотного кольца» из неагглютинированных эритроцитов
+++ интенсивная реакция, агглютинированные эритроциты образуют так называемые «зонтики», в центре которых, явно видны кольца, образованные осевшими неагглютинированными эритроцитами
++++ резко интенсивная реакция, в которой агглютинируются все эритроциты и, образуя «зонтики», выстилают дно лунок.
Титром данной реакции считают последнее разведение сыворотки, при котором выявляется явная агглютинация эритроцитов не менее +++, то есть при интенсивной или резко интенсивной реакции.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Принцип метода заключается в своеобразном взаимодействии антитела с антигеном. Одним из обязательных условий реакции является предварительная фиксация одного из её компонентов, то есть антигена или антитела, на твёрдых планшетах. Затем, при помощи ферментной метки обнаруживают возникнувшие комплексы антиген – антитело благодаря изменению оптической плотности первоначальной смеси (субстрата), что проявляется изменением интенсивности её окраски. ИФА свойственны некоторые преимущества перед остальными серологическими методами, например, данная реакция является наиболее чувствительной, в тестах используются универсальные реагенты, остающиеся стабильными не менее 6 месяцев, автоматизированный процесс учёта результатов реакции. Набор, необходимый для проведения реакции, содержит следующие компоненты: паразитарный антиген, специфические сывороточные антитела, конъюгат, планшета с зафиксированным на ней специфическим паразитарным антигеном, контрольные сыворотки.
Постановка реакции ИФА происходит в несколько этапов: вначале производится приготовление необходимых растворов, затем готовятся исследуемые образцы сывороток, а также контрольные сыворотки, позже следует нанесение приготовленных образцов сыворотки и контрольных сывороток на твёрдофазные носители, планшеты инкубируются, промываются и, только после проведённых процедур в лунки планшет вносится конъюгат. Через некоторое время он удаляется путём промывания лунок. На завершающем этапе в лунки вносится субстратная смесь и выдерживается в тёмном месте при комнатной температуре. Оценка результатов проводится автоматически при помощи специальных измерительных приборов, в некоторых случаях допускается визуальный учёт результатов проведённой реакции.
Достоверность и качество методов серологической диагностики зависят от организации проведённого внутреннего и внешнего лабораторного контроля, состоящих из нескольких независимых процедур, предназначенных для оценки качества результатов проведённого анализа.

§ 14. Способы повышения чувствительности реакций

На чувствительность реакции влияют разнообразные факторы, поэтому для химика-аналитика большое значение приобретают способы повышения чувствительности реакции.

Поскольку чувствительность реакции обусловлена открываемым минимумом, минимальной, концентрацией и предельным разбавлением, т. е. связана с концентрацией открываемого вещества, то естественно, что повышение чувствительности реакции в первую очередь может быть достигнуто в результате повышения концентрации дайного вещества в растворе.

Повысить чувствительность реакции можно, применяя химически чистые реактивы, свободные от каких-либо посторонних примесей, мешающих данной реакции, а также предварительным отделением или маскировкой посторонних ионов, мешающих реакции.

Для этого применяют выпаривание растворов; предварительное осаждение в виде малорастворимого соединения с последующим растворением его в подходящем растворителе; экстракцию соединений органическими растворителями; дистилляцию; избирательную адсорбцию ионов на твердом веществе—адсорбенте и другие специальные методы.

Метод соосаждения. Во многих случаях требуется определять в различных природных и технических объектах химические элементы при их содержании *<10-5—10_6%. Определение таких малых количеств элементов, минуя стадию концентрирования, не всегда может быть осуществлено с помощью даже высокочувствительных методов. Поэтому для таких анализов определяемые элементы предварительно концентрируют различными способами. Одним из наиболее простых и эффективных способов концентрирования является соосаоюдение.

В анализируемый раствор специально вносят небольшое количество постороннего вещества (катиона или аниона) и осаждают его соответствующим реактивом в виде малорастворимого соединения. На осадке, называемом коллектором (собирателем), в процессе его образования соосаждаются (концентрируются) следы определяемых: ионов.

Коллектор, как показывает опыт, тем полнее адсорбирует ионы, чем меньше их концентрация.

Метод соосаждения на коллекторе широко применяется в аналитической практике.

Соосадителями могут быть неорганические, органические и смешанные соединения. В качестве неорганических соосадителей применяют гидроокись или фосфат железа, гидроокись алюминия и другие неорганические соединения, нерастворимые в данной среде. В качестве органических соосадителей применяют малорастворимые органические соединения, образующиеся при добавлении к анализируемым растворам, содержащим органические катионы или анионы, солей тяжелых органических ионов противоположного заряда. Реагентами, поставляющими органические катионы, являются метиловый фиолетовый, /г-диме-

тиламиноазобензол, родамины и другие соединения. В качестве реагентов, поставляющих анионы, применяют нафталин-а-сульфокислоту, метиловый оранжевый и другие соединения, содержащие сульфогруппы.

Органические соосадители отличаются рядом преимуществ по сравнению с неорганическими и смешанными коллекторами, образованными ионами металлов при действии органических осадителей и комп-лексообразующих веществ. Например, они легко озоляются, что позволяет получать соосажденные элементы практически в чистом виде; они отличаются достаточно большой селективностью, что дает возможность соосаждать следы ионов определяемых элементов в присутствии других посторонних ионов; наконец, при их помощи достигается количественное выделение ионов из предельно разбавленных растворов с концентрацией определяемого элемента до 1 : 1013.

Существует несколько точек зрения, объясняющих механизм сооса-ждения ионов определяемых элементов с неорганическими и органическими коллекторами: 1) образование твердых растворов; 2) адсорбция ионов или соединений соосаждаемого элемента на поверхности сооса-дителя; 3) образование соосаждаемым соединением элемента центров кристаллизации, на которых происходит отложение выпадающего со-осадителя; 4) ионный обмен и др.

Большую роль в развитии методов соосаждения сыграли работы советских ученых В. И. Кузнецова (по органическим соосадителям) и В. Т. Чуйко (по неорганическим соосадителям).

Пример соосаждения. Метод соосаждения был использован В. И. Кузнецовым для определения содержания урана в морской воде.

Содержание урана в морской воде так мало, что непосредственно определить его ни в воде, ни в сухом остатке после выпаривания воды не удается. Для концентрирования урана используют различные приемы. Малые количества урана можно выделить соосаждением его с гидроокисью или с фосфатом железа или алюминия. Кузнецовым было применено соосаждение урана с органическими соединениями. При действии избытка роданида в кислой среде уран образует слабодиссоцнирующий роданидный анион «, который может быть количественно соосажден малорастворимыми роданидами тяжелых органических катионов, например роданидами основных красителей (метилового фиолетового и др.).

Вместе с ураном выделяются все ионы, образующие комплексные роданидные анионы или нерастворимые роданиды, т. е. Zn++, Fe+++, Ag+, Hg++, Cd+\ Bi+++, MoVI и др. В присутствии комплексона III (двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, трилон Б) число соосаждаемых ионов уменьшается. Осадок отфильтровывают и озоляют. Уран, отделенный от солей, содержавшихся в морской воде, остается в золе. Дальнейшее определение урана не вызывает особых затруднений. Количественное соосаждение урана этим методом достигается из растворов с концентрацией 1 : 1010.

Метод экстракции. Для разделения смесей, содержащих растворимые в органических растворителях компоненты, применяют извлечение того или иного вещества из водного раствора с помощью органического растворителя (экстрагента), не смешивающегося с водой. Такой процесс называют экстрагированием (или экстракцией). Вещество, растворимое в воде и органическом растворителе, распределяется между двумя несмешивающимися слоями жидкости. При этом отношение активностей (а) или концентраций (С) в обеих жидкостях при данной температуре есть величина постоянная:

C2 а2

Органический растворитель подбирают так, чтобы в нем количественно растворялось определяемое вещество и плохо или совсем не растворялись другие компоненты анализируемого продукта.

Для выделения вещества в чистом виде экстракт подвергают выпариванию, высушиванию, перегонке или кристаллизации.

Метод экстракции органическими растворителями отличается рядом преимуществ по сравнению с другими методами повышения концентрации:

1) можно извлечь определяемое вещество из очень разбавленного раствора, т. е. повышается чувствительность метода;

2) не происходит соосаждения и экстрагируемое вещество количественно выделяют в чистом виде;

3) оказывается возможным выделять и разделять вещества, которые трудно или невозможно разделить другими способами.

Экстракцию в сочетании с другими методами применяют как для качественного, так и для количественного анализа.

Ионы железа (III) экстрагируют из солянокислого водного раствора эфиром в виде HFeCl4. Ионы лития отделяют в виде LiCl от других щелочных металлов экстрагированием ацетоном, в котором нерастворимы хлориды натрия, калия и др. Роданидные комплексы железа, кобальта, молибдена экстрагируются смесью изоами-лового спирта и эфира. Соединения некоторых металлов с органическими реагентами — купфероном, оксихинолином, дитизоном и др. — экстрагируются эфиром, хлороформом, четыреххлористым углеродом и т. д.

В качественном анализе экстракцию используют для разделения веществ и извлечения окрашенных в характерный цвет соединений.

Факторы, понижающие чувствительность реакций. Следует учитывать, что при изменении факторов, оказывающих существенное влияние на реакции, чувствительность реакции может быть не только повышена, но и понижена.

Например, нагревание, способствующее увеличению скорости реакции, приводит к повышению растворимости осаждаемого соединения, в результате чего чувствительность реакции понижается.

Прибавление избытка реактива благоприятствует повышению чувствительности реакции, но иногда приводит к растворению осадка (вследствие образования комплексного иона) и чувствительность реакции уменьшается. Например, осаждение Hg»14* в виде красного кристаллического осадка HgI2 при избытке добавляемого иодида приводит к растворению HgI2 с образованием комплексного аниона:

Hg++ +2Г —> IHgI2 HgI2 + 21″ —> —

Силъно влияет на чувствительность реакции рН среды. Многие реакции протекают в строго определенной среде, т. е. при определенных значениях рН. При несоблюдении этого условия реакции не происходят или протекают в нежелательном направлении.

Например, при окислении смеси, содержащей Ch, Br* и I», перман-ганатом калия чувствительность реакции повышается по мере увеличения концентрации ионов водорода. При рН = 5 IM раствор КМПО4 окисляет только I» до I2, не оказывая действия на Br- и Cl», при рН = 3 окисляется также Br- до Br2, а при рН < 1 окисляется и С1~ до Cl2.

Поэтому, если нужно последовательно окислить указанные ионы, то следует придерживаться строго определенных значений рН среды. При несоблюдении этого условия реакция не пойдет совсем или сразу все ионы окислятся перманганатом.

К Содержанию

Серодиагностика инфекционных заболеваний.

Иммунные реакции используют при диа­гностических и иммунологических исследо­ваниях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген—антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.
Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др.
При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.
В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммуните­та характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.
Особенности взаимодействия антитела с ан­тигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция invitroмеж­ду антигеном и антителом состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза — более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).
Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

53. Реакция агглютинации. Компоненты…

РА — простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или др. клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них Аг). Она протекает при наличии электролитов (физ. р-р). Применяются различные варианты РА: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. РА проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра). РА используют для: 1) определения АТ в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и др; 2) определения возбудителя, выделенного от больного; 3) определения групп крови с использова­нием моноклональных АТ против аллоантигенов эритроцитов. Для определения у больного АТ ставят развернутую РА:к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация. Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную РА,применяя диагностические АТ (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую РА в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.

54. Реакция преципитации.

РП — это формирова­ние и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения — преципитата. Он образуется при смешивании Аг и АТ в эквивалентных количес­твах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое рас­пространение получили разновидности РП в полужидком геле агара: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.
Механизм. Проводится с прозрачными коллоид­ными растворимыми Аг, экстрагированными из патоло­гического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагности­ческие преципитирующие сыворотки с высокими титрами АТ. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение Аг, которое при взаимодействии с иммун­ной сывороткой вызывает помутнение.
Реакция кольцепреципитацииставится в узких пробирках, в которые вносят по 0,2—0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1—0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции через 1—2 мин. Положительная реакция — на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется пре­ципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преци­питат не образуется.

55. Нагрузочные серологические реакции. РНГА

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА)основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности Аг или АТ, взаимодействие которых с соот­ветствующими АТ или Аг сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов в виде осадка.Для постанов­ки РНГА используют эритроциты барана, лошади, человека и др, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ, экстракты бактериальных вакцин и др. Эритроциты, сенсибилизированные АГ — эритроцитарнй диагностикум. Для его приготовления используют эритроциты барана. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарствам, гормонам и др. РНГА отличается большей специфич­ностью, чем РА. Ее используют для идентификации возбудителя по его Аг-структуре или для индикации и идентификации токси­нов в исследуемом материале. Соответственно используют стандартные эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих АТ на поверхности обработанных танином эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. В каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

56. Реакция иммунофлюоресценции. …

РИФ — метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.
Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на спо­собности некоторых флюорохромов вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.
Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что Аг тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с АТ, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса Аг — АТ с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем АТ, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах АТ выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи АТ + антикроличьи АТ, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого ма­териала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей АТ против Аг возбудителя. Для образования комплекса Аг — АТ препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавших­ся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресци­рующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кро­лика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на Аг специфическими АТ образуются светящиеся комплексы Аг — АТ, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

57. ИФА. Иммуноблоттинг

Иммуноферментный анализили метод — выявление Аг с помощью соответствующих им АТ, конъюгированных с ферментом-меткой (щелочной фосфатазой). После соединения Аг с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интен­сивность окраски прямо пропорциональна количеству свя­завшихся молекул Аг и АТ. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных бо­лезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепати­та В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекар­ственных препаратов и других биологически активных ве­ществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (1010-1012 г/л).

Твердофазный ИФА— вариант теста, когда один из компо­нентов иммунной реакции (Аг, АТ) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых Аг или АТ. При положительном результате изменяется цвет хромоге­на. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,
I. При определении АТ в лунки планшеток с сорбированным Аг последовательно добавляют сы­воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме­ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.
II. При определении Аг в лунки с сорби­рованными АТ вносят Аг (напр. сыворотку кро­ви с искомым Аг), добавляют диагностическую сыво­ротку против него и вторичные АТ (против диагностиче­ской сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хро­моген для фермента. Конкурентный ИФА для определения Аг: искомый Аг и меченный ферментом Аг конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества АТ иммунной сыворотки.
Другой тест — конкурентный ИФА для определения АТ: искомые АТ и меченные ферментом АТ конкурируют друг с дру­гом за Аг, сорбированные на твердой фазе.
Иммуноблоттинг — высокочувстви­тельный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг ис­пользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.
Аг возбудителя разделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антиге­нов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся АТ боль­ного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

58. Реакция нейтрализации токсина антитоксином.

АТ иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувст­вительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных Аг антителами. РН проводят путем введения смеси Аг — АТ животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия м/о­ или их Аг, токсинов говорят о нейтрализу­ющем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о спе­цифичности взаимодействия комплекса Аг — АТ. Для прове­дения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свин­кам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследу­емого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сыво­роткой, животные опытной группы останутся живыми. Конт­рольные животные погибнут в результате действия экзотоксина

59. Антитоксический иммунитет,активный и пассивный.Антимикробные и антитоксические сыворотки.

Иммунитет антитоксический — иммунитет в отношении токсинов, продуцируемых микроорганизмами, растениями, животными.

• Активно приобретенный иммунитет развивается после иммунизации ослабленными или убитыми микроорганизмами либо их антигенами. В обоих случаях организм активно участвует в создании невосприимчивости, отвечая развитием иммунного ответа и формированием пула клеток памяти.
• Пассивно приобретенный иммунитет достигается введением готовых АТ или, реже, сенсибилизированных лимфоцитов. В таких ситуациях иммунная система реагирует пассивно, не участвуя в своевременном развитии соответствующих иммунных реакций.

Антитоксические сыворотки. Получение, очистка, титро­вание.
Антитоксические гетерогенные сыворотки получаются путем гипериммунизации различных животных. Они называются гетерогенными т.к. содержат чужеродные для человека сывороточные белки. Более предпочтительным является применение гомологичных антитоксических сывороток, для получения которых используется сыворотка переболевших людей (коревая, паротидная), или специально иммунизированных доноров (противостолбнячная, противоботулинистическая), сыворотка из плацентарной а так же абортивной крови, содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания.
Для очистки и концентрирования антитоксических сывороток используют методы: осаждение спиртом или ацетоном на холоде, обработка ферментами, аффинная хроматография, ультрафильтрация.
Активность иммунных антитоксических сывороток выражают в антитоксических единицах, т. е. тем наименьшим кол-вом антител, которое вызывает видимую или регистрируемую соответствующим способом реакцию с определённым кол-вом специфического антигена. Активность антитоксической противостолбнячной сыворотки и соответствующего Ig выражается в антитоксических единицах.
Антитоксические сыворотки применяются для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена).

Антимикробные сыворотки содержат антитела против клеточных антигенов возбудителя. Их получают иммунизацией животных клетками соответствующих возбудителей и дозируют в миллилитрах. Антимикробные сыворотки могут применяться при лечении:
• сибирской язвы;
• чумы;
• стрептококковых инфекций;
• стафилококковой инфекции;
• синегнойной инфекции.
Их назначение определяется тяжестью течения заболевания и, в отличие от антитоксических, не является обязательным.

60. Понятие об аллергии…

Аллерги́я — сверхчувствительность иммунной системы организма при повторных воздействиях аллергена на ранее сенсибилизированный этим аллергеном организм.

Изучение механизмов аллер­гии привело к созданию Джейлом и Кумбсом новой классификации. В соответствии с ней различают четыре основных типа аллер­гии: анафилактический (I тип), цитотоксический (IIтип), иммунокомплексный (IIIтип) и опосредованный клетками (IV тип). Первые три типа относятся к ГНТ, четвертый — к ГЗТ. Ведущая роль в запуске ГНТ играют антитела (IgE, G и М), а ГЗТ — лимфоидно-макрофагальная реакция. Аллергическая реакция I типа связана с биологическими эффектами IgE, на­званных реагинами, которые обладают сродством к тучным клеткам и базофилам. Эти клетки несут на поверхности высокоаффинный Fc-рецептор, связывающий IgE. Связывание аллергена с рецепторным комплексом вызывает дегрануляцию базофила и тучной клетки — выброс БАВ (гистамин, гепарин и др.), содержащихся в гранулах, в межклеточное пространство. В результате развиваются бронхоспазм, вазодилатация, отек и прочие симптомы, характерные для анафилаксии. Вырабатываемые цитокины стимулируют клеточное звено иммунитета: образование Т2-хелпера и эозинофилогенез. Цитотоксические антитела (IgG, IgM), на­правленные против поверхностных Аг соматических клеток макроорга­низма, связываются с клеточными мембра­нами клеток-мишеней и запускают различ­ные механизмы антителозависимой цитотоксичности (аллергическая реакция II типа). Массивный цитолиз сопровождается соот­ветствующими клиническими проявлениями. Гемолити­ческая болезнь в результате резус-конфликта или переливания иногруппной крови. Цитотоксическим действием обладают так­же комплексы Аг — АТ, образующи­еся в организме пациента в большом количес­тве после введения массивной дозы Аг (аллергическая реакция III типа). В связи с кумулятивным эффектом клини­ческая симптоматика аллергической реакции III типа имеет отсроченную манифестацию, иногда на срок более 7 суток. Тем не менее, этот тип реакции относят к ГНТ. Реакция может проявляться как одно из осложнений от при­менения иммунных гетерологичных сыворо­ток с лечебно-профилактической целью («сы­вороточная болезнь»), а также при вдыхании белковой пыли («легкое фермера»). Аллергены — это Аг, вызывающие у чувствительных к ним людей аллергические реакции. В зависимости от происхождения аллергены можно разделить на несколько групп: бытовые — домашняя и бытовая пыль, мел и его раствор в воде; эпидермальные — шерсть, пух, перо, перхоть, экскременты, слюна домашних животных, эпидермис человека; инсектные — синантропные микроклещи, тараканы, жалящие и кровососущие насекомые; пыльцевые — пыльца различных растений; пищевые — потенциально любой пищевой продукт может быть аллергеном. Особенно опасны морепродукты, животный белок, клубника, цитрусовые; лекарственные; грибковые — основной компонент домашней пыли, чаще плесневые и дрожжевые грибки; гельминтные .Кроме того, аллергенами в переносном смысле называют причины возникновения аллергии: термические — ветер, мороз, незначительный холод и любые его проявления; морально-биологические — нервный срыв, переживание, страх, волнение.

61. Гиперчувствительностъ немедленного типа. Меха­низмы реакции.Атопия.Анафилаксия
Гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ) — ги­перчувствительность, обусловленная антителами (IgE, IgG, IgM) против аллергенов. Развивается через не­сколько минут или часов после воздействия аллергена: рас­ширяются сосуды, повышается их проницаемость, развивают­ся зуд, бронхоспазм, сыпь, отеки. Поздняя фаза ГНТ дополня­ется действием продуктов эозинофилов и нейтрофилов.
Основные типы реакций гиперчувствительности

I тип — анафилактический. Первичное поступление аллергена вызывает продук­цию плазмоцитами IgE, IgG4. Синтезированные IgE прикрепляются Fc-фрагментом к Fc-peцепторам базофилов в крови и тучных клеток в слизистых оболочках, соединительной ткани. При повторном поступ­лении аллергена на тучных клетках и базофилах образуются комплексы IgE с аллергеном , вызывающие дегрануляцию клеток.
Клинические проявления гиперчувствительности I типа могут протекать на фоне атопии. Атопия — наследственная предрасположенность к развитию ГНТ, обусловленная повы­шенной выработкой IgE-антител к аллергену, повышенным количеством Fc-рецепторов для этих антител на тучных клет­ках, особенностями распределения тучных клеток и повы­шенной проницаемостью тканевых барьеров.
Анафилактический шок — протекает остро с развитием коллапса, отеков, спазма гладкой мускулатуры; часто заканчи­вается смертью. Крапивница — увеличивается проницае­мость сосудов, кожа краснеет, появляются пузыри, зуд. Бронхиальная астма — развиваются воспаление, бронхо-спазм, усиливается секреция слизи в бронхах.

II тип — цитотоксический. Антиген, расположенный на клетке «узнается» антителами классов IgG, IgM. При взаимо­действии типа «клетка-антиген-антитело» происходит актива­ция комплемента и разрушение клетки по трем направлениям: комплементзависимый цитолиз; фагоцитоз; антителозависимая клеточная цитотоксичность. Время реакции — минуты или часы.

III тип — иммунокомплексный. Антитела классов IgG, IgM образуют с растворимыми антигенами иммунные комплексы, которые активируют комплемент. При избытке антигенов или недостатке комплемента иммунные комплексы откладывают­ся на стенке сосудов, базальных мембранах, т. е. структурах, имеющих Fc-рецепторы.
Реакция может быть общей (например, сывороточная бо­лезнь) или вовлекать отдельные органы, ткани, включая ко­жу (например, системная эритематозная волчанка, реакция Артюса), почки (например, волчаночный нефрит), легкие (например, аспергиллез) или другие органы. Эта реакция может быть обусловлена многими микроорганизмами. Она развивается через 3-10 часов после экспозиции антигена

62. Трансплантационный иммунитет.Антигеныгистосовместимости их строение.

Трансплантационный иммунитет — состояние повышенной иммунной реактивности организма, возникающее в ответ на пересадку органа или ткани, взятых от другой, генетически отличающейся особи

Функция трансплантационного иммунитета: обеспечивает элиминацию из организма чужеродных в генетическом отношении клеточных элементов, а также собственных клеток, синтезирующих чужеродные вещества или адсорбировавших чужеродные антигены.

Стадии трансплантационного иммунитета:1)Распознавания чужеродного трансплантата (осуществляется в регионарных лимфоузлах, при контакте Т-лимфоцитов с антигенами трансплантата).2)Иммунизации — размножение клона ЦТТ-лимф (Т-киллеры), попадающих в кровоток и концентрирующихся в сосудах и тканях трансплантата.3)Разрушения — продукция медиаторов

Трансплантационные антигены — расположены на поверхности любых ядросодержащих клеток, строго контролируются генами гистосовместимости. У человека наибольшее их количество содержится в лимфоидной ткани, селезенке, лимфоузлах, коже.

Система трансплантационных антигенов (HLA), обеспечивает биологическую индивидуальность организма, осуществление иммунологического надзора, приводящего к повреждению, гибели и удалению из организма антигенно чужеродных клеток и тканей.

Реакции трансплантационною иммунитета тем сильнее, чем больше выражены генетические различия между донором и реципиентом. Развитие Т. и. приводит к гибели пересаженной ткани. Состояние иммунитета при трансплантации развивается в основном по типу гиперчувствительности замедленного типа. Повышенная чувствительность к пересаженной ткани возникает примерно через 1—2 нед. после трансплантации и сохраняется в течение от 1 мес. до нескольких лет. Иммунологическая реакция при пересадке аллогенных клеток может иметь прямо противоположную форму и исходить со стороны иммунокомпетентных клеток пересаженной ткани против организма реципиента — реакция трансплантата против хозяина (РТПХ). Эта реакция наблюдается преимущественно при трансплантации костного мозга, когда иммунная реактивность реципиента понижена

Необходимым условием возникновения Т. и. и реакции трансплантат против хозяина являются различия между организмом больного и пересаженной тканью по антигенам гистосовместимости, которые представляют собой самую сложную систему среди известных генетических маркеров человека и контролируются генами, расположенными на хромосоме рядом или в тех же областях. Эти гены определяют силу иммунного ответа, продукцию антител и клеточные реакции. В первую очередь к антителам совместимости относится система HLA (Human leucocyte antigens), в которой насчитывают приблизительно 120 антигенов.

Методы подавления трансплантационного иммунитета:

Тщательный подбор доноров

Применение иммунодепрессантов

Создание толерантности(на данный момент- в эксперименте)

63. Серопрофилактика и серотерапия. Анафилактический шок и сывороточная…

Серопрофилактика и серотерапия, или Пассивная иммунизация, осуществляется двумя видами сывороточных препаратов: иммуноглобулинами человека (ИГЧ) и гетерологичными сыворотками, полученными от гипериммунизированных животных. Экстренная профилактика сывороточными препаратами проводится лицам, не привитым против соответствующей инфекции и ранее не болевшим ею в возможно более ранние сроки после вероятного инфицирования.
По своим свойствам ИГЧ подразделяют на 2 группы — ИГЧ нормальный и специфические ИГЧ.
Препараты гетерологичных сывороток используют в основном для экстренной профилактики и лечения токсинемических, а также некоторых вирусных и бактериальных инфекций.
Помимо вышеуказанных препаратов выпускаются иммунные сыворотки, нейтрализующие яд змей (гюрзы, эфы, кобры) и паука каракурта.
Для профилактики анафилактического шока перед введением любой лошадиной сыворотки обязательна постановка внутрикожной пробы с разведенной 1:100 лошадиной сывороткой.

Анафилаксия пред­ставляет собой реакцию немедленного типа, возникающую при повторном введении Аг в ответ на повреждающее действие комплекса Аг-АТ и характеризу­ющуюся стереотипно протекающей клинической и морфологи­ческой картиной.
Основную роль в анафилаксии играет IgE, име­ющий сродство к базофилам и тучным клеткам. После первого контакта организма с Аг обра­зуется IgE, который адсорбируется на поверхности названных выше клеток. При повторном попадании в организм этого же антигена IgE связывается с Аг. В ответ на это клетки выделяют медиато­ры — гистамин и гистаминоподобные вещества. Эти медиаторы связываются рецепторами на поверхности функциональных мышечных, секреторных, сли­зистых и др клеток, вызывая соответствующие реакции (сокращение гладкой мускулатуры бронхов, кишеч­ника, мочевого пузыря, повышение проницаемости сосудов и другим, функциональным и морфологическим изменениям, ко­торые сопровождаются клиническим проявлением). Клинически — одышка, удушье, слабость, беспокойства, судороги, непроизвольное мочеиспускание, дефе­кация и др.

Сывороточной болезнью называют реакцию, возникающую при разовом парентеральном введении больших доз сывороточных и других белковых препаратов. Обычно реакция возникает спустя 10—15 сут. Механизм сывороточной болезни связан с образова­нием антител против введенного чужеродного белка и повреждающим действием на клетки комплексов Аг-АТ. Клинически сывороточная болезнь проявляется отеком кожи и слизистых оболочек, повышением температуры, припуханием суставов, сыпью и зудом; наблюдаются измене­ния в крови (увеличение СОЭ, лейкоцитоз и др.).

Профилактика этих болезней – проведение вакцинации по способу Безредки: сначала препарат вводят в малой дозе, через 1-1,5 ч основная доза.

64. Т-зависимая гиперчувствительность замедленного типа.

характеризуются тем, что:
— Антитела в крови отсутствуют.
— Реакции возникают через 24 – 48 часов (и позже) после введения антигена в сенсибилизированный организм.
— Реакции чаще возникают при контакте аллергена с кожей.
— Пассивный перенос гиперчувствительности осуществляется не с сывороткой крови, а с лейкоцитами, клетками лимфоидной ткани.

Гиперчувствительность немедленного типа с вязана с В- системой иммунитета, гиперчувствительность замедленного типа – с Т- системой. В зависимости от формы аллергии проявляются реакции гиперчувствительности того или иного типа. К Т-зависимым аллергическим реакциям относятся: реакция отторжения трансплантата, замедленная аллергия к растворимым белкам, ряд аутоаллергических реакций, контактный аллергический дерматит. Т-зависимая аллергия играет важную роль при повышенной чувствительности к микробактериям туберкулеза, а также при некоторых других инфекциях .Замедленные аллергические реакции возникают преимущественно при помощи Т-активных клеток.

Аллергические пробы — биологические реакции для диагностики ряда заболеваний, основанные на повышенной чувствительности организма, вызванной аллергеном.
При многих инфекционных заболеваниях за счет активации кле­точного иммунитета развивается повышенная чувствительность организма к возбудителям и продуктам их жизнедеятельности. На этом основаны аллергические пробы, используемые для диагно­стики бактериальных, вирусных, протозойных инфекций, мико­зов и гельминтозов.
Все аллергические пробы подразделяют на две группы — про­бы invivoи invitro.
К первой группе (invivo)относятся кожные пробы, осуществ­ляемые непосредственно на пациенте и выявляющие аллергию немедленного (через 20 мин) и замедленного (через 24 — 48 ч) типов.
Аллергические пробы invitroоснованы на выявлении сенсиби­лизации вне организма больного. Их применяют тогда, когда по тем или иным причинам нельзя произвести кожные пробы, либо в тех случаях, когда кожные реакции дают неясные результаты.
Для проведения аллергических проб используют аллергены — диагностические препараты, предназначенные для выявления специфической сенсибилизации организма.

Недостатки метода:

1. Адаптивные организационные структуры: достоинства, недостатки, особенности применения на практике
2. Вопрос 5. Теория ХУ МакГрегора: характеристика, преимущества, недостатки
3. Глава 13. Достоинства и недостатки
4. Глава 15. ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ РЫНОЧНОГО МЕХАНИЗМА
5. Групповые водопроводы. Преимущества недостатки групповых водопроводов.
6. Достоинства и недостатки метода наблюдения.
7. ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ РЕКЛАМЫ
8. Достоинства и недостатки современного урока.
9. Достоинства и недостатки трафаретной печати. Схемы траф.печати
10. Задание 2. Сравни сочинения учеников. Выяви их достоинства и недостатки. Выставь баллы по критериям.
11. Кредитные организации, имеющие отдельные недостатки в деятельности
12. Критика(недостатки)

Лекция №1

Методы лабораторной диагностики бактериальных инфекций. Бактерии – возбудители кишечных инфекций. Характеристика кишечной палочки и ее значение для макроорганизма. Заболевания, вызываемые кишечной палочкой. Принципы их лабораторной диагностики, лечения и профилактики.

Для диагностики инфекционных болезней в настоящее время широко используют лабораторные методы исследования. К ним относятся следующие методы:

1. Микроскопические.

2. Микробиологические.

3. Биологические (биопроба).

4. Серологические.

5. Аллергические.

6. Молекулярно-генетические.

Выбор методов исследования зависит от предварительного диагноза заболевания.

Материалом для исследования может быть кровь, спинномозговая жидкость, мокрота, кал, моча, желчь, рвотные массы, слизь из зева, носа, отделяемое уретры, шейки матки, пунктаты органов, и.т.д, что зависит от характера, формы, периода болезни.

Микросопический метод основан на микроскопии мазков приготовленных из патологического материала. Мазки могут быть нативными, фиксированными и окрашенными.

Преимущество метода: простота и быстрота получения результата (30-60 минут).

Недостатки метода:

1) частая невозможность видовой идентификации возбудителей (например, патогенных энтеробактерий);

2) необходимость достаточного количества возбудителя в исследуемом материале.

Метод в большинстве случаев является ориентировочным. Однако в диагностике некоторых инфекций (например, менингита, лептоспироза, возвратного тифа, сифилиса) этот метод может быть основным.

Достоверность метода повышается при проведении иммунофлюоресцентного исследования. Этот метод основан на обработке препаратов из исследуемого материала специальными сыворотками, содержащими антитела к возбудителю, меченные флюорохромами. Меченые антитела соединяются с соответствующим антигеном, который выявляется. Под люминесцентным микроскопом вокруг этих комплексов видна зона свечения.

В настоящее время этот метод широко применяется для обнаружения различных микроорганизмов в патологическом материале.

Микробиологический методоснован на выделении чистой культуры возбудителя из патологического материала и ее идентификации. Выделение проводят путем его посева на соответствующие питательные среды. Идентификацию чистых культур проводят по морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным, токсигенным и другим признакам.

Преимущества метода:

1) высокая информативность и достоверность;

2) возможность определения in чувствительности выделенной культуры к антибиотикам и назначения рациональной химиотерапии;

3) возможность выявления бактерионосителей среди различных групп населения;

4) возможность расшифровки эпидемиологической цепочки (источник инфекции, пути ее передачи) на основании идентификации био-, серо-, фаговаров возбудителей.

Недостаток метода : длительность исследования (от 2-4 дней до 3-4 недель — 2 месяцев).

Метод является основным в диагностике большинства инфекций.

Биологический метод основан на заражении исследуемым материалом лабораторных животных с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя (или его токсина), а также для постановки диагноза по клинической картине заболевания.

Преимущества метода:

1) возможность выделения возбудителя, когда он не растет или плохо культивируется на искусственных питательных средах (например, возбудители туляремии, риккетсиозов, хламидиозов);

2) возможность выделения возбудителя при обильном загрязнении патологического материала посторонней микрофлорой;

3) возможность дифференциации патогенных микроорганизмов (например, возбудителей эндемического и эпидемического риккетсиозов) и определение их вирулентности;

4) возможность изучить иммунитет и эффективность лечебно-профилактических препаратов.

Недостатки метода:

• трудоемкость;

• дороговизна;

• гибель лабораторных животных (в результате инфекционного процесса или специального умерщвления).

Биопроба на животных применяется главным образом при зоонозах, а также для обнаружения токсинов ( например, ботулинического).

Серологический метод направлен на обнаружение антител в сыворотке больного (серодиагностика) и на выявление антигенов возбудителей (сероидентификация) непосредственно в исследуемом материале.

Для серодиагностики и сероидентификации применяются различные высокочувствительные иммунологические реакции: агглютинации, РНГА,РСК, преципитации,иммунофлюоресценции, иммуноферментный, радиоиммунный анализ.

При серодиагностике в качестве антигенов используют живые культуры микроорганизмов или диагностикумы – убитые взвеси микроорганизмов или экстракты из них, полученные химическим путем.

Для сероидентификации возбудителей применяют диагностические сыворотки с высоким содержанием антител и выраженной специфичностью.

Преимущества серологического метода:

1) является одним из основных в диагностике вирусных инфекций и риккетсиозов (в связи с трудностями выделения и идентификации этих возбудителей);

2) быстрота получения результатов;

3) высокая чувствительность;

4) позволяет оценить эффективность вакцинопрофилактики;

5) позволяет провести эпидемиологический анализ инфекциооной заболеваемости.

Основной недостаток метода: относительная достоверность, так как могут быть положительные результаты серологических исследований не только у больных, но и у лиц, перенесших соответствующую инфекцию в прошлом (анамнестическая реакция) или у получавших профилактические прививки (прививочная реакция).

Возможны ложноположительные результаты при идентификации антигенов возбудителей в связи с широким антигенным родством между родами и видами внутри каждого семейства и даже среди различных семейств.

В целом серологический метод в лабораторной практике чаще имеет вспомогательное значение и не может заменить бактериологическое исследование.

Аллергический методоснован на выявлении повышенной чувствительности организма к специфическому аллергену, которым является возбудитель заболевания. Для выявления такой чувствительности ставят кожно-аллергические пробы. Человеку, у которого предполагают наличие заболевания, сопровождающегося аллергией (туберкулез, бруцеллез, туляремия, сап, сибирская язва и др.), вводят внутрикожно малые количества аллергена из возбудителя данной инфекции (убитые микробные клетки или извлеченные из них антигенные комплексы или продукты жизнедеятельности возбудителя). При наличии инфекционной аллергии через 24-72 часа возникает воспалительная реакция в виде гиперемии, инфильтрата, отека кожи. В основе положительной кожной реакции лежит клеточная реакция ГЗТ, которая отражает специфическую повышенную чувствительность организма к инфекционному аллергену. Она возникает в результате текущего, перенесенного заболевания, вакцинации или инфицирования организма.

Кроме кожно-аллергических проб используются методы аллергодиагностики in vitro (реакции лейкоцитолиза, торможения миграции лейкоцитов, лимфобласттрансформации), позволяющие оценить состояние специфической сенсибилизации лейкоцитов крови в отношении определенного антигена.

Преимущество аллергического метода: высокая специфичность.

Недостатки метода:

1) положительные реакции наблюдаются не только у больных, но у переболевших или ранее иммунизированных против этих инфекций лиц;

2) внутрикожные пробы способствуют нежелательной дополнительной сенсибилизации организма (методы аллергодиагностики in vitro лишены этого недостатка;

3) метод применим в диагностике заболеваний, сопровождающихся аллергией к возбудителю, то есть имеет ограниченное использование.

В последнее время используется новая группа методов-молекулярно-генетические. Они применяются для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а также гонококков, микобактерий и др. Эти методы основаны на идентификации ДНК. К ним относятся:

а) метод гибридизации нуклеиновых кислот; основан на способности ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). В дальнейшем образцы исследуют различными методами (например, ИФА).

б) полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на многократном образовании копий определенного участка ДНК с получением большого количества изучаемого фрагмента ДНК даже в том случае, если в распоряжении имелась всего одна исходная молекула геномной ДНК. Идентификацию копий ДНК проводят методом электрофореза.

Преимущества методов:

1) высокая специфичность и чувствительность;

2) высокая достоверность;

3) универсальность;

4) быстрота и информативность.