Полимеразная цепная реакция

Диагностика методом ПЦР: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Сферы применения метода в клинической медицине

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

  1. Урогинекология . Для инфекционных заболеваний такого рода характерны слабая выраженность симптомов и хроническое течение, нередко вызывающие бесплодие и невынашивание беременности у женщин. С помощью ПЦР можно выявить наличие целого «букета» половых инфекций: хламидиоза, нескольких видов микоплазмы, уреаплазмы, трихомониаза, гарднереллы, кандиды, гонококка, трепонемы. Кроме этого, ПЦР-диагностике поддается и группа вирусов, поражающих урогенитальный тракт у обоих полов, в особенности, вирус герпеса и вирус папилломы человека. Их своевременное выявление и лечение помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.
  2. Неонатология . Существует множество микроорганизмов, способных поражать плод еще в утробе матери. ПЦР-диагностика позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.
  3. Служба крови . Чтобы избежать риска переливания, пациентам инфицированной опасными заболеваниями крови или плазмы (ВИЧ, сифилис, гепатиты) также используется метод ПЦР. Он значительно превосходит по точности серологические методы, поскольку способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.
  4. Клиника инфекционных заболеваний . К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия, токсоплазмоз и другие инфекции.
  5. Фтизиатрия и пульмонология . ПЦР-диагностика позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, которыми являются хламидии и микоплазмы. Кроме того, с ее помощью можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР используется также для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

На заметку
ПЦР-диагностика используется в криминалистике для определения принадлежности найденного на месте преступления биоматериала, а также в экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии, ветеринарии.

Преимущества ПЦР-диагностики

Хотя ПЦР-диагностика и является относительно «молодым» методом, широкое распространение в медицинской практике она получила благодаря явным преимуществам перед другими способами анализа:

  • Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
  • Высокая специфичность метода . Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
  • Высокая чувствительность . При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
  • Универсальность . Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
  • Скорость получения результатов . Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
  • Диагностика латентных инфекций . ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Ограничения метода

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

  • Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
  • Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
  • Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Этапы исследования методом ПЦР

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

  1. Забор биоматериала . Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
    • Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
    • Моча . Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
    • Мокрота . Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
    • Кровь, сыворотка, плазма . С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
    • Биологические жидкости . К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
    • Биоптаты , т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
  2. Хранение и транспортировка биоматериала . Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
  3. Выделение ДНК из образца . Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
  4. Проведение ПЦР . Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные , включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные , не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
  5. Регистрация результатов . Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
  6. Интерпретация результатов исследования . Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Цены на ПЦР-диагностику

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1 . Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Название анализа Цена, руб.
Определение ДНК хламидия 750
Определение ДНК микоплазмы хоминис 540
Определение микоплазмы гениталиум 350
Определение ДНК уреаплазмы 350
Гонококк, определение ДНК 350
Определение ДНК герпеса (разные типы) 350–600
Определение ДНК кандиды 570
Вирус краснухи, определение РНК 800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы) 350–1900

Итак, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно. В пакет услуги диагностики включается сразу несколько анализов, например, «ПЦР-8» (8 бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) — 1400 рублей или «ПЦР-12» (12 половых инфекций) — 3500 рублей. Такая услуга позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку при отдельном прохождении ПЦР-диагностики по каждой инфекции затраты будут намного больше.

ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.

Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.

Основные ингредиенты ПЦР:

Полимераза

Полимераза — это фермент, который при правильных условиях может собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была громоздкой, потому что высокие температуры, необходимые для денатурации ДНК, разрушали полимеразу. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы необходимо было добавлять в реакцию вручную — дорогостоящее мероприятие. Эта проблема решена в современных методах, так как полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух термофильных источников, бактерий Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus. Эти полимеразы, соответственно, Taq (произносится «липкость») и Pfu (произносится «PFU»), легко выдерживают высокие температуры. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu спроектированы с учетом скорости, точности, способность завершать длительное чтение и читать шаблоны, богатые GC. Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на то, «что находится в вашем морозильнике», а ищите лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд. Также поговорите со своим местным торговым представителем, поскольку он часто может раздавать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.

Шаблон ДНК

Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша шаблонная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК. Чем более целостная и чистая ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно 1 пг — 1 нг плазмидной ДНК или 1 нг — 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.

Праймеры

Праймеры — это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей шаблонной ДНК. Вам нужно будет разработать один «прямой» праймер и один «обратный». Прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как у вашей ДНК-матрицы 5´-3´. Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратно комплементарной ДНК вашего шаблона. Обычно праймеры имеют длину 18-22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, является температура плавления ваших: она должна быть 54-60 ° С и максимально совпадать для обоих праймеров. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитывать температуры отжига праймеров, и большинство компаний, которые синтезируют праймеры, предоставляют такие калькуляторы.

Нуклеотиды

Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий. В большинстве экспериментов вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания и оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их правильно — не используйте морозильную камеру, которая проходит автоматические циклы размораживания.

Буфер

Большинство коммерческих полимераз поставляются с идеально подобранным буфером, который обеспечивает не только правильный рН, но и всегда содержит добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирование, ренатурирование и полимеразную активность ДНК.

Термоциклирование

Вот где происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляют в пробирку для ПЦР, которую затем термоциклируют. При изобретении ПЦР отдельные пробирки вручную перемещали между водяными банями с подогревом. Теперь, благодаря изобретению термоциклеров (или амплификаторов), регулирование температуры осуществляется автоматически. Ниже приведен типичный алгоритм работы амплификатора ПЦР:

  1. Инициализация

На этом этапе реакцию нагревают до 94-96°С в течение от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую ​​полимеразу, и для денатурации вашей шаблонной ДНК.

  1. Денатурация (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе смесь нагревают до 94-98°С в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжигать друг друга на следующем шаге.

  1. Отжиг (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе температура вашей реакции быстро понижается до 50-64°C в течение 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы ваши денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований с вашей шаблонной ДНК. Но достаточно высокой, чтобы могли образовываться только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже чем температура плавления вашей пары праймеров. Также на этом этапе ваша полимераза будет связываться с вашим комплексом ДНК праймер / матрица. Полимераза не начнет чтение, пока температура не повысится на следующем шаге.

  1. Удлинение или элонгация (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе реакционная смесь быстро нагревается до 72-80°C. В этот момент полимераза начинает чтение в направлении 5´-3´ и копировать ДНК шаблона в направлении 3´-5´. Более высокая температура на этом этапе уменьшает неспецифические взаимодействия ДНК праймера / матрицы, тем самым увеличивая специфичность реакции. Тем не менее, точная температура будет зависеть от предпочтения вашей полимеразы, поэтому перед экспериментом обязательно прочитайте инструкцию. Длина этого шага зависит от того, как долго будет длиться процесс копирования. Как правило, ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Поэтому вам нужно выдержать смесь как минимум 1 минуту для копирования 1000 пар оснований. В конце инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.

Затем шаги 2-4 повторяют 15-40 раз

Чем больше циклов вы проведете, тем больше копий ДНК вы получите. Тем не менее, есть верхний предел. В какой-то момент доступные свободные нуклеотиды становятся ограничивающими, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте. Лучше получить меньше чистого продукта ПЦР, нежели большое количество сильно загрязненного.

  1. Окончательное удлинение

Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этом этапе реакцию проводят при 70-74°С в течение нескольких минут. Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на шаге элонгации. Этот шаг позволяет полимеразам завершить считывание того участка, на котором они находятся в данный момент. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.

  1. Финальная задержка

Ваша реакция теперь завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи. Рекомендуется запрограммировать ваш термоциклер на хранение продукта ПЦР при температуре 4°С до вашего возвращения. Советуем также прочесть статью о том, как провести ПЦР за 30 минут В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт, или перенести его в более подходящее долговременное хранилище, например, в холодильник.

Удачи и счастливого ПЦР!

Метод ПЦР

Суть метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR – polymerase chain reaction) – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце.

Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. Синонимом процесса копирования ДНК является «амплификация». Репликация ДНК in vivo также может считаться амплификацией. Однако в отличие от репликации, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидов).

Основные принципы

Итак, ПЦР — это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают «праймеры» (затравки) — синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК — двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:

  1. денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) — 95°С — 1 или 2 минуты;
  2. отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) — 60°С (к примеру) — 1 минута;
  3. элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) — 72°С — 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).

Приборная база для применения метода полимеразной цепной реакции в лаборатории должна состоять из:

  1. амплификатора(или, как его еще называют, термоциклера);
  2. системы для гель-электрофореза с источником питания (для визуализации результатов ПЦР);
  3. системы гель-документации(для анализа результатов ПЦР);
  4. ПЦР-бокса(для пробоподготовки);
  5. вортекса;
  6. микроцентрифуги;
  7. набора автоматических дозаторов (механических или электронных).

Помимо основного и вспомогательного оборудования для полноценного функционирования ПЦР-лаборатории, необходимы некоторые расходные материалы: стерильные наконечники, пробирки, штативы для пробирок и дозаторов.

Реагентная база в обычной ПЦР-лаборатории для проведения полноценной полимеразной цепной реакции включает в себя фермент ДНК-полимеразу с буфером, праймеры (небольшие синтетические фрагменты ДНК, комплементарные началу и концу анализируемого участка ДНК-матрицы), смесь нуклеотидов (А, Т, Г, Ц). Также абсолютно необходима очищенная вода.

Достоинства метода ПЦР

Высокая чувствительность исследования

Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток.

Специфичность анализа

ПЦР позволяет выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. Специфически подбирая компоненты реакции (праймеры), Вы можете одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.

Универсальность метода ПЦР

Дело в том, что для ПЦР-диагностики инфекционных заболеваний, либо наследственных заболеваний человека можно использовать одно и то же оборудование, следовать универсальным процедурам подготовки образцов (проб) и постановки анализа, а также однотипные наборы реактивов.

Экономия времени

Важное преимущество ПЦР – отсутствие стадий культуральной микробиологической работы. Подготовка образцов, проведение реакции и анализ результатов максимально облегчен и во многом автоматизирован. Благодаря этому, время получения результата может сокращаться до 4-5 часов.

Эффективность метода ПЦР

ПЦР помогает избежать известных сложностей, возникающих при выращивании труднокультивируемых, некультивируемых или персистирующих форм микроорганизмов для диагностики латентных и хронических инфекций. Эффективен метод ПЦР и при скрининге возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, а также внутриклеточных паразитов.

Широта исследуемого клинического материала

В качестве образца при полимеразной цепной реакции может быть использован не только биологический материал от больного, но также и многие другие субстраты, в которых могут быть идентифицированы молекулы ДНК с высокой чувствительностью, например, вода, почва, продукты питания, микроорганизмы, смывы и многое другое.

Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода — высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы – позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях.

Применение ПЦР

Области применения полимеразной цепной реакции как современного метода молекулярной биологии разнообразны. Во многом это обусловлено широтой материала, который можно анализировать (практически все, из чего можно выделить более-менее качественую ДНК может стать объектом исследования), а также подобранных праймеров. Основные области применения ПЦР:

клиническая медицина

  • диагностика инфекционных заболеваний
  • диагностика наследственных заболеваний
  • выявление мутаций
  • генотипирование
  • клеточные технологии
  • создание генетических паспортов

экология

  • мониторинг состояния окружающей среды
  • анализ продуктов питания
  • анализ генетически-модифицированных организмов (ГМО)

судебная медицина и криминалистика

  • идентификация личности
  • установление отцовства

фармакология

ветеринария

научные исследования (молекулярная биология, генетика)

Организация лаборатории ПЦР

  • Общая информация по организации ПЦР-лабораторий
  • Требования к организации помещений для лаборатории ПЦР
  • Главная проблема лабораторий ПЦР
  • Классическая ПЦР-лаборатория
  • ПЦР в модификации FLASH
  • Расходные материалы в ПЦР-лаборатории
  • Нормативно-правовые документы по ПЦР

Информация для заказа

Наименование Объем Производство Метод Кат.Номер
PrecisionShuttle pTUNE Индуцируемый Вектор OriGene PS100021
Вода без нуклеаз R0582
Наконечники Vertex на 10 мкл, с фильтром, бесцветные, градуированные, стерильные, 96 шт/штатив SSI SSI-4117NSFS
Наконечники Vertex на 10 мкл, с фильтром, удлиненные, бесцветные, градуированные, стерильные, 96 шт/штатив SSI SSI-4137NSFS
Ноутбук с предустановленным специализированным программным обеспечением (для ДТ-96, ДТ-322, Джин-4, Джин) ДНК-Технология ПЦР в реальном времени I-PC/01
Устройство для запечатывания микропланшет»ДТпак» ДНК-Технология ПЦР в реальном времени O-DTPACK

Появление метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) радикально трансформировало биологическую науку с момента его первого появления (Кэри Муллис, 1990). Метод позволил реализовать специфическое обнаружение и наладить производство больших количеств ДНК. ПЦР дала толчок исследованиям в области генетики, таким как «Проект генома человека». В настоящее время этот метод широко используется в клинических и научных исследованиях для генной диагностики и клонирования последовательности НК, а также быстро и с высокой точностью проводить сложные количественные и геномные исследования. Одним из наиболее важных медицинских применений классической ПЦР является обнаружение патогенов. Кроме того, данный анализ используется в судебной медицине. Из-за его широкого использования важно понять основные принципы ПЦР и то, как его использование может быть изменено для обеспечения сложного анализа генов и генома.

Процесс

ПЦР представляет собой простой, но элегантный, ферментативный анализ, который позволяет амплифицировать (увеличивать количество копий) специфический фрагмент ДНК из смеси из множества молекул нуклеиновых кислот. Доктор Муллис (Mullis), открывший ПЦР, заявил, что «метод позволяет вам выбрать фрагмент ДНК, который вам интересен, и сделать столько копий, сколько вам нужно» (Mullis, 1990). ПЦР можно проводить с использованием исходной ДНК из различных тканей и организмов, включая периферическую кровь, кожу, волосы, слюну и микроорганизмы. Для ПЦР необходимы только следовые количества ДНК, чтобы генерировать достаточное количество копий для анализа с использованием обычных лабораторных методов. По этой причине ПЦР является очень чувствительным анализом.

Принципиальная схема полимеразной цепной реакции

Каждый ПЦР-анализ требует наличия матричной ДНК, праймеров, нуклеотидов и ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза является ключевым ферментом, который связывает отдельные нуклеотиды вместе с образованием конечного продукта реакции. Нуклеотиды включают четыре основания — аденин, тимин, цитозин и гуанин (A, T, C, G). Они действуют как строительные блоки, которые используются ДНК-полимеразой для создания результирующего продукта. Праймеры в реакции указывают на ДНК-продукт, подлежащий амплификации. Они представляют собой короткие фрагменты ДНК с определенной последовательностью, комплементарной ДНК-мишени, которая должна быть обнаружена и амплифицирована. Они служат точкой расширения ДНК-полимеразы.

Амплификатор Invitrogen Verity

Вышеупомянутые компоненты смешивают в пробирке или 96-луночном планшете, а затем помещают в амплификатор (или термоциклер), что позволяет проводить повторяющиеся циклы амплификации ДНК на трех основных этапах. Прибор имеет тепловой блок с отверстиями, в которые вставлены пробирки или планшеты, содержащие реакционную смесь. Амплификатор поднимает и понижает температуру блока на дискретных, точных и запрограммированных этапах. Реакционный раствор сначала нагревают выше точки плавления двух комплементарных нитей ДНК-мишени, что позволяет разделить двухцепочечную молекулу на отдельные нити, процесс, называемый денатурацией. Затем температуру снижают, чтобы позволить праймерам связаться с целевыми фрагментами ДНК, процесс, известный как гибридизация или отжиг. Отжиг между праймерами и ДНК-мишенью происходит только в том случае, если они комплементарны в последовательности. Температура снова повышается, и в это время ДНК-полимераза способна расширять праймеры путем добавления нуклеотидов к развивающейся нити ДНК. При каждом повторении этих трех шагов число копируемых молекул ДНК удваивается.

В настоящее время на рынке представлено очень большое количество амлификаторов для ПЦР различных производителей, таких как Thermo Fisher Scientific, Eppendorf, Roche и другие.

Заказать амплификатор, а также получить консультацию специалистов по подбору оборудования и расходных материалов вы можете на сайте компании Пущинские лаборатории www.laboratorii.com

Применение в медицине

В клинической диагностике метод ПЦР получил очень широкое распространение благодаря своей высокой чувствительности а также относительно небольшому (от 20 до 60 минут) времени проведения анализа. Используется он в областях, перечисленных ниже:

  • Онкология.
  • Урология.
  • Гематология.
  • Гастроэнтерология.
  • Пульмонология.
  • Физиатрия и прочие медицинские разделы.

С помощью ПЦР определяют такие заболевания, как гепатиты C и B, ВИЧ, СПИД, хламидиоз и многие другие. Проводится анализ методом полимеразной цепной реакции на образцах крови.

Анализ продукта ПЦР

Существует два основных способа визуализации продуктов ПЦР

  • окрашивание амплифицированного ДНК-продукта химическим красителем, таким как бромид этидия, который интеркалирует между двумя нитями дуплекса или
  • помечая ПЦР-праймеры или нуклеотиды флуоресцентными красителями (флуорофорами) до амплификации.

Электрофорез в агарозном геле (Источник wikipedia.org)

Последний метод позволяет непосредственно помещать эти метки в продукт ПЦР. Наиболее широко используемым методом анализа продукта является использование электрофореза в агарозном геле, который разделяет продукты ДНК по размерам и заряду. Данный вид электрофореза является самым простым методом визуализации и анализа результатов ПЦР, который позволят определить наличие мишени.

Полимеразная цепная реакция, используемая для обнаружения конкретной цепи ДНК, называется качественной. Качественная ПЦР является хорошей методикой получения ДНК для клонирования или идентификации патогенна.

Количественная ПЦР

Real-time амплификатор QuantStudio

Количественные данные в реальном времени (qRT-PCR, реал-тайм ПЦР) позволяющие получить дополнительную информацию помимо простого обнаружения определенной последовательности. Реал-тайм ПЦР указывает, какая часть конкретной ДНК или гена присутствует в образце. qRT-PCR позволяет одновременно обнаруживать и количественно определять продукт ПЦР в режиме реального времени, в то время как он синтезируется. Два распространенных метода, используемых для обнаружения и количественного определения продукта, включают флуоресцентные красители, которые неспецифически интеркалируют с двухцепочечной ДНК и последовательно-специфичные ДНК-зонды, состоящие из флуоресцентно меченных последовательностей. Флуоресценция возникает только после гибридизации зонда с его комплементарной ДНК-мишенью. ПЦР в реальном времени можно комбинировать с обратной транскрипцией, которая позволяет превращать РНК в кДНК (обратная транскрипция), после чего количественную оценку кДНК выполняют с помощью qPCR. Количественное определение желаемого гена во время экспоненциальной амплификации позволяет избежать проблем, связанных с конечной точкой ПЦР, которая анализируется после завершения окончательного цикла ПЦР.

Микропробирки для ПЦР

Анализ опухолей является идеальным примером использования ПЦР. Ее можно использовать для выделения и амплификации ДНК генов-супрессоров опухолей или протоонкогенов. В свою очередь, количественная ПЦР может быть использована для количественного определения выделенного конкретного гена. С другой стороны, количественная ПЦР может быть использована для анализа отдельных клеток и количественной оценки любой комбинации ДНК, мРНК и белков.

Преимущества и ограничения ПЦР

Для ПЦР существует несколько преимуществ. Во-первых, это простой для понимания метод, который быстро дает результаты и использования. Во-вторых, это высокочувствительный метод, способный производить огромное количество копий определенного продукта для секвенирования, клонирования и анализа. Это справедливо и для количественной реал-тайм ПЦР, но она имеет преимущество количественного определения синтезируемого продукта. Таким образом, его можно использовать для анализа изменений уровней экспрессии генов в опухолях, микробах или других болезненных состояниях.

Хотя ПЦР является ценным методом, у нее есть ограничения. Поскольку она является высокочувствительной методикой, любая форма загрязнения (контаминации) образца даже следовыми количествами ДНК может приводить к ошибочным результатам. Кроме того, для разработки праймеров необходимы некоторые данные предварительной последовательности. Поэтому ПЦР можно использовать только для идентификации присутствия или отсутствия известного патогена или гена. Другое ограничение заключается в том, что праймеры, используемые для ПЦР, могут отжигать неспецифические последовательности, которые являются сходными, но не полностью идентичными ДНК-мишени. Кроме того, неправильные нуклеотиды могут быть включены в последовательность ДНК-полимеразой, хотя и с очень низкой скоростью.

Резюме

ПЦР представляет собой простой и широко используемый метод, при котором мелкие количества ДНК могут быть амплифицированы в большое количество копий. В дополнение к быстроте, с которой работает этот анализ, он способен количественно продемонстрировать, какая часть конкретной последовательности присутствует. Как и во всех методах, справедливость результатов следует сравнивать со спецификой, связанной с этим методом. Будущее ПЦР является многообещающим, сочетая различные анализы и подходы для лучшего понимания различных комбинаций генов. Например, в исследовании по связыванию отдельных таксонов в микробном сообществе с конкретными метаболическими процессами стабильное зондирование изотопов было объединено с qPCR. Эксперименты с микрочипом могут быть подтверждены подходом qPCR из-за его быстроты.